Mga kadahilanan ng panghihimasok sa mga reaksyon ng PCR

Sa panahon ng reaksyon ng PCR, ang ilang mga nakakasagabal na mga kadahilanan ay madalas na nakatagpo.
Dahil sa napakataas na pagiging sensitibo ng PCR, ang kontaminasyon ay itinuturing na isa sa pinakamahalagang kadahilanan na nakakaapekto sa mga resulta ng PCR at maaaring makagawa ng mga maling positibong resulta.
Ang pantay na kritikal ay ang iba't ibang mga mapagkukunan na humantong sa mga maling-negatibong resulta. Kung ang isa o higit pang mahahalagang bahagi ng pinaghalong PCR o ang reaksyon ng pagpapalakas mismo ay hinarang o nakagambala, ang diagnostic assay ay maaaring hadlangan. Maaari itong humantong sa nabawasan na kahusayan at kahit na maling negatibong mga resulta.
Bilang karagdagan sa pagsugpo, ang pagkawala ng integridad ng target na nucleic acid ay maaaring mangyari dahil sa pagpapadala at/o mga kondisyon ng imbakan bago ang paghahanda ng sample. Sa partikular, ang mataas na temperatura o hindi sapat na imbakan ay maaaring humantong sa pinsala ng mga cell at nucleic acid. Ang pag -aayos ng cell at tisyu at pag -embed ng paraffin ay kilalang mga sanhi ng pagkasira ng DNA at isang patuloy na problema (tingnan ang Mga figure 1 at 2). Sa mga kasong ito, kahit na ang pinakamainam na paghihiwalay at paglilinis ay hindi makakatulong.

Larawan 1 | Epekto ng immobilization sa integridad ng DNA
Ang agarose gel electrophoresis ay nagpakita na ang kalidad ng DNA na nakahiwalay mula sa mga seksyon ng paraffin ng mga autopsies ay iba -iba. Ang DNA ng iba't ibang mga average na haba ng fragment ay naroroon sa mga extract depende sa paraan ng pag -aayos. Ang DNA ay napanatili lamang kapag naayos sa mga katutubong frozen na sample at sa buffered neutral formalin. Ang paggamit ng isang malakas na acidic bouin fixative o unbuffered, formic acid na naglalaman ng formalin ay nagresulta sa isang makabuluhang pagkawala ng DNA. Ang natitirang bahagi ay lubos na nagkalat.
Sa kaliwa, ang haba ng mga fragment ay ipinahayag sa mga pares ng kilobase (KBP)

Larawan 2 | Pagkawala ng integridad ng mga target na nucleic acid
(a) Isang puwang ng 3′-5 ′ sa parehong mga strands ay magreresulta sa isang pahinga sa target na DNA. Ang synthesis ng DNA ay magaganap pa rin sa maliit na fragment. Gayunpaman, kung ang isang primer na site ng pagsusubo ay nawawala sa fragment ng DNA, tanging ang linear amplification ay nangyayari. Sa pinaka -kanais -nais na kaso, ang mga fragment ay maaaring mag -resaturate sa bawat isa, ngunit ang mga ani ay magiging maliit at sa ibaba ng mga antas ng pagtuklas.
. Sa panahon ng pinahabang yugto ng pag -init, ang mga panimulang aklat ay matunaw ang layo mula sa matrix DNA at hindi magsasagawa kahit na sa ilalim ng hindi gaanong mahigpit na mga kondisyon.
(c) Ang mga katabing mga base ng thymine ay bumubuo ng isang tt dimer.
Ang isa pang karaniwang problema na madalas na nangyayari sa mga molekular na diagnostic ay ang mas mababa kaysa-optimal na paglabas ng mga target na nucleic acid kumpara sa pagkuha ng phenol-chloroform. Sa matinding kaso, maaari itong maiugnay sa mga maling negatibo. Karamihan sa oras ay maaaring mai -save sa pamamagitan ng kumukulong lysis o enzymatic digestion ng mga labi ng cell, ngunit ang pamamaraang ito ay madalas na nagreresulta sa mababang pagkasensitibo ng PCR dahil sa hindi sapat na paglabas ng nucleic acid.

Paglikha ng aktibidad ng polymerase sa panahon ng pagpapalakas

Sa pangkalahatan, ang pagsugpo ay ginagamit bilang isang konsepto ng lalagyan upang ilarawan ang lahat ng mga kadahilanan na humantong sa mga resulta ng suboptimal na PCR. Sa isang mahigpit na kahulugan ng biochemical, ang pagsugpo ay limitado sa aktibidad ng enzyme, ibig sabihin, binabawasan o pinipigilan ang conversion-product conversion sa pamamagitan ng pakikipag-ugnay sa aktibong site ng DNA polymerase o cofactor nito (EG, MG2+ para sa TAQ DNA polymerase).
Ang mga sangkap sa sample o iba't ibang mga buffer at extract na naglalaman ng mga reagents ay maaaring direktang mapigilan ang enzyme o bitag ang mga cofactors nito (EG EDTA), sa gayon ay hindi aktibo ang polymerase at naman na humahantong sa nabawasan o maling negatibong mga resulta ng PCR.
Gayunpaman, maraming mga pakikipag-ugnayan sa pagitan ng mga sangkap ng reaksyon at target na naglalaman ng mga nucleic acid ay itinalaga din bilang 'PCR inhibitors'. Kapag ang integridad ng cell ay nagambala sa pamamagitan ng paghihiwalay at ang nucleic acid ay pinakawalan, ang mga pakikipag -ugnayan sa pagitan ng sample at ang nakapalibot na solusyon at solidong yugto ay maaaring mangyari. Halimbawa, ang 'scavengers' ay maaaring magbigkis ng solong- o dobleng-stranded na DNA sa pamamagitan ng mga pakikipag-ugnay na hindi covalent at makagambala sa paghihiwalay at paglilinis sa pamamagitan ng pagbabawas ng bilang ng mga target na kalaunan ay umabot sa vessel ng reaksyon ng PCR.
Sa pangkalahatan, ang mga inhibitor ng PCR ay naroroon sa karamihan ng mga likido sa katawan at reagents na ginagamit para sa mga klinikal na pagsusuri sa diagnostic (urea sa ihi, hemoglobin at heparin sa dugo), mga pandagdag sa pandiyeta (mga organikong sangkap, glycogen, taba, ca2+ ions) at mga sangkap sa kapaligiran (phenols, mabibigat na metal)

Ang higit na laganap na mga inhibitor ng PCR ay matatagpuan sa mga bakterya at eukaryotic cells, hindi target na DNA, DNA-binding macromolecules ng mga matrice ng tisyu at kagamitan sa laboratoryo tulad ng guwantes at plastik. Ang paglilinis ng mga nucleic acid sa panahon o pagkatapos ng pagkuha ay ang ginustong pamamaraan para sa pag -alis ng mga inhibitor ng PCR.
Ngayon, ang iba't ibang mga awtomatikong kagamitan sa pagkuha ay maaaring palitan ang maraming manu -manong mga protocol, ngunit ang 100% na pagbawi at/o paglilinis ng mga target ay hindi pa nakamit. Ang mga potensyal na inhibitor ay maaari pa ring naroroon sa purified nucleic acid o maaaring naganap na. Ang iba't ibang mga diskarte ay umiiral upang mabawasan ang epekto ng mga inhibitor. Ang pagpili ng naaangkop na polymerase ay maaaring magkaroon ng isang makabuluhang epekto sa aktibidad ng inhibitor. Ang iba pang mga napatunayan na pamamaraan upang mabawasan ang pagsugpo sa PCR ay ang pagtaas ng konsentrasyon ng polymerase o pag -aaplay ng mga additives tulad ng BSA.
Ang pag -iwas sa mga reaksyon ng PCR ay maaaring ipakita sa pamamagitan ng paggamit ng panloob na control ng kalidad ng proseso (IPC).
Ang pag -aalaga ay dapat gawin upang alisin ang lahat ng mga reagents at iba pang mga solusyon sa extraction kit, tulad ng ethanol, EDTA, CETAB, LICL, GUSCN, SDS, isopropanol at phenol, mula sa nucleic acid na ihiwalay sa pamamagitan ng isang masusing hakbang sa paghuhugas. Depende sa kanilang konsentrasyon, maaari silang buhayin o pigilan ang PCR.