Mga salik ng panghihimasok sa mga reaksyon ng PCR

Sa panahon ng reaksyon ng PCR, madalas na nakakaharap ang ilang mga nakakasagabal na salik.
Dahil sa napakataas na sensitibidad ng PCR, ang kontaminasyon ay itinuturing na isa sa pinakamahalagang salik na nakakaapekto sa mga resulta ng PCR at maaaring magdulot ng mga maling positibong resulta.
Gayundin kahalaga ang iba't ibang pinagmumulan ng mga maling negatibong resulta. Kung ang isa o higit pang mahahalagang bahagi ng PCR mixture o ang mismong amplification reaction ay nahahadlangan o naapektuhan, maaaring maantala ang diagnostic assay. Maaari itong humantong sa pagbaba ng kahusayan at maging sa mga maling negatibong resulta.
Bukod sa inhibition, ang pagkawala ng integridad ng target na nucleic acid ay maaaring mangyari dahil sa mga kondisyon ng pagpapadala at/o pag-iimbak bago ang paghahanda ng sample. Sa partikular, ang mataas na temperatura o hindi sapat na pag-iimbak ay maaaring humantong sa pinsala ng mga selula at nucleic acid. Ang cell at tissue fixation at paraffin embedding ay kilalang mga sanhi ng fragmentation ng DNA at isang patuloy na problema (tingnan ang Mga Larawan 1 at 2). Sa mga kasong ito, kahit ang pinakamainam na paghihiwalay at paglilinis ay hindi makakatulong.

Pigura 1 | Epekto ng immobilisasyon sa integridad ng DNA
Ipinakita ng agarose gel electrophoresis na ang kalidad ng DNA na nakahiwalay mula sa mga paraffin section ng mga autopsy ay lubhang nag-iiba. Ang DNA na may iba't ibang average na haba ng fragment ay naroroon sa mga extract depende sa paraan ng pag-aayos. Ang DNA ay napreserba lamang kapag naayos sa mga katutubong nakapirming sample at sa buffered neutral formalin. Ang paggamit ng isang malakas na acidic na Bouin fixative o unbuffered, formic acid-containing formalin ay nagresulta sa isang malaking pagkawala ng DNA. Ang natitirang fraction ay lubos na pira-piraso.
Sa kaliwa, ang haba ng mga fragment ay ipinapahayag sa kilobase pairs (kbp)

Pigura 2 | Pagkawala ng integridad ng mga target ng nucleic acid
(a) Ang 3′-5′ na puwang sa magkabilang hibla ay magreresulta sa pagkaputol ng target na DNA. Magkakaroon pa rin ng sintesis ng DNA sa maliit na piraso. Gayunpaman, kung walang primer annealing site sa piraso ng DNA, linear amplification lamang ang magaganap. Sa pinakapaborableng kaso, maaaring mag-resaturate ang mga piraso sa isa't isa, ngunit ang mga ani ay magiging maliit at mas mababa sa antas ng pagtuklas.
(b) Ang pagkawala ng mga base, pangunahin dahil sa depurination at pagbuo ng thymidine dimer, ay humahantong sa pagbaba ng bilang ng mga H-bond at pagbaba ng Tm. Sa panahon ng pinahabang yugto ng pag-init, ang mga primer ay matutunaw palayo sa matrix DNA at hindi mag-aanneal kahit na sa ilalim ng hindi gaanong mahigpit na mga kondisyon.
(c) Ang magkakatabing mga base ng thymine ay bumubuo ng isang TT dimer.
Ang isa pang karaniwang problema na kadalasang nangyayari sa mga molecular diagnostic ay ang hindi gaanong optimal na paglabas ng mga target na nucleic acid kumpara sa phenol-chloroform extraction. Sa matinding mga kaso, maaari itong maiugnay sa mga maling negatibo. Malaking oras ang maaaring matipid sa pamamagitan ng pagpapakulo ng lysis o enzymatic digestion ng mga labi ng cell, ngunit ang pamamaraang ito ay kadalasang nagreresulta sa mababang PCR sensitivity dahil sa hindi sapat na paglabas ng nucleic acid.

Pagsugpo sa aktibidad ng polymerase habang nagpapalaki

Sa pangkalahatan, ang inhibition ay ginagamit bilang isang konsepto ng lalagyan upang ilarawan ang lahat ng mga salik na humahantong sa mga suboptimal na resulta ng PCR. Sa isang mahigpit na biochemical na kahulugan, ang inhibition ay limitado sa aktibidad ng enzyme, ibig sabihin, binabawasan o pinipigilan nito ang conversion ng substrate-product sa pamamagitan ng interaksyon sa aktibong site ng DNA polymerase o sa cofactor nito (hal., Mg2+ para sa Taq DNA polymerase).
Ang mga bahagi sa sample o iba't ibang buffer at extract na naglalaman ng mga reagent ay maaaring direktang pumigil sa enzyme o makulong ang mga cofactor nito (hal. EDTA), sa gayon ay pinapahina ang polymerase at siya namang humahantong sa pagbaba o maling negatibong resulta ng PCR.
Gayunpaman, maraming interaksyon sa pagitan ng mga bahagi ng reaksyon at mga nucleic acid na naglalaman ng target ang itinalaga rin bilang 'mga PCR inhibitor'. Kapag ang integridad ng selula ay nasira ng paghihiwalay at ang nucleic acid ay inilabas, maaaring mangyari ang mga interaksyon sa pagitan ng sample at ng nakapalibot nitong solusyon at solidong yugto. Halimbawa, ang mga 'scavenger' ay maaaring magbigkis sa single- o double-stranded na DNA sa pamamagitan ng mga interaksyon na hindi covalent at makagambala sa paghihiwalay at paglilinis sa pamamagitan ng pagbabawas ng bilang ng mga target na kalaunan ay umaabot sa daluyan ng reaksyon ng PCR.
Sa pangkalahatan, ang mga PCR inhibitor ay matatagpuan sa karamihan ng mga likido sa katawan at mga reagent na ginagamit para sa mga klinikal na pagsusuri sa pagsusuri (urea sa ihi, hemoglobin at heparin sa dugo), mga suplemento sa pagkain (mga organikong sangkap, glycogen, taba, mga ion ng Ca2+) at mga sangkap sa kapaligiran (mga phenol, mabibigat na metal).

Ang mas laganap na mga PCR inhibitor ay matatagpuan sa bacteria at eukaryotic cells, non-target DNA, DNA-binding macromolecules ng tissue matrices at mga kagamitan sa laboratoryo tulad ng mga guwantes at plastik. Ang paglilinis ng mga nucleic acid habang o pagkatapos ng extraction ang mas mainam na paraan para sa pag-alis ng mga PCR inhibitor.
Sa kasalukuyan, maaaring palitan ng iba't ibang automated extraction equipment ang maraming manual protocol, ngunit ang 100% recovery at/o purification ng mga target ay hindi pa nakakamit. Ang mga potensyal na inhibitor ay maaaring naroroon pa rin sa mga purified nucleic acid o maaaring nagkabisa na. May iba't ibang estratehiya upang mabawasan ang epekto ng mga inhibitor. Ang pagpili ng angkop na polymerase ay maaaring magkaroon ng malaking epekto sa aktibidad ng inhibitor. Ang iba pang napatunayang mga pamamaraan upang mabawasan ang PCR inhibition ay ang pagpapataas ng konsentrasyon ng polymerase o paglalapat ng mga additives tulad ng BSA.
Ang pagsugpo sa mga reaksyon ng PCR ay maaaring maipakita sa pamamagitan ng paggamit ng internal process quality control (IPC).
Kailangang maging maingat sa pag-alis ng lahat ng reagent at iba pang solusyon sa extraction kit, tulad ng ethanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol at phenol, mula sa nucleic acid isolate sa pamamagitan ng masusing paghuhugas. Depende sa kanilang konsentrasyon, maaari nilang i-activate o i-inhibit ang PCR.