Mga kadahilanan ng pagkagambala sa mga reaksyon ng PCR

Sa panahon ng reaksyon ng PCR, ang ilang mga nakakasagabal na kadahilanan ay madalas na nakatagpo.
Dahil sa napakataas na sensitivity ng PCR, ang kontaminasyon ay itinuturing na isa sa pinakamahalagang salik na nakakaapekto sa mga resulta ng PCR at maaaring magbunga ng mga maling positibong resulta.
Ang parehong kritikal ay ang iba't ibang mga mapagkukunan na humahantong sa maling-negatibong mga resulta. Kung ang isa o higit pang mahahalagang bahagi ng pinaghalong PCR o ang amplification reaction mismo ay napigilan o nagambala, ang diagnostic assay ay maaaring hadlangan. Maaari itong humantong sa pagbawas ng kahusayan at kahit na mga maling negatibong resulta.
Bilang karagdagan sa pagsugpo, ang pagkawala ng target na integridad ng nucleic acid ay maaaring mangyari dahil sa mga kondisyon sa pagpapadala at/o imbakan bago ang paghahanda ng sample. Sa partikular, ang mataas na temperatura o hindi sapat na imbakan ay maaaring humantong sa pagkasira ng mga cell at nucleic acid. Ang pag-aayos ng cell at tissue at pag-embed ng paraffin ay kilalang sanhi ng pagkapira-piraso ng DNA at isang patuloy na problema (tingnan ang Mga Larawan 1 at 2). Sa mga kasong ito, kahit na ang pinakamainam na paghihiwalay at paglilinis ay hindi makakatulong.

Larawan 1 | Epekto ng immobilization sa integridad ng DNA
Ang agarose gel electrophoresis ay nagpakita na ang kalidad ng DNA na nakahiwalay sa mga seksyon ng paraffin ng mga autopsy ay nag-iba nang malaki. Ang DNA ng iba't ibang average na haba ng fragment ay naroroon sa mga extract depende sa paraan ng pag-aayos. Ang DNA ay napanatili lamang kapag naayos sa mga katutubong frozen na sample at sa buffered neutral formalin. Ang paggamit ng isang malakas na acidic na Bouin fixative o unbuffered, formic acid-containing formalin ay nagresulta sa isang malaking pagkawala ng DNA. Ang natitirang bahagi ay lubos na pira-piraso.
Sa kaliwa, ang haba ng mga fragment ay ipinahayag sa mga pares ng kilobase (kbp)

Larawan 2 | Pagkawala ng integridad ng mga target ng nucleic acid
(a) Ang isang 3′-5′ na agwat sa parehong mga hibla ay magreresulta sa pagkasira sa target na DNA. Ang synthesis ng DNA ay magaganap pa rin sa maliit na fragment. Gayunpaman, kung ang isang panimulang lugar ng pagsusubo ay nawawala sa fragment ng DNA, ang linear na amplification lamang ang nangyayari. Sa pinaka-kanais-nais na kaso, ang mga fragment ay maaaring muling magsama-sama sa isa't isa, ngunit ang mga magbubunga ay magiging maliit at mas mababa sa antas ng pagtuklas.
(b) Ang pagkawala ng mga base, pangunahin dahil sa depurination at pagbuo ng thymidine dimer, ay humahantong sa pagbaba sa bilang ng mga H-bond at pagbaba sa Tm. Sa panahon ng pinahabang yugto ng pag-init, ang mga panimulang aklat ay matutunaw mula sa matrix DNA at hindi mag-anneal kahit na sa ilalim ng hindi gaanong mahigpit na mga kondisyon.
(c) Ang mga katabing base ng thymine ay bumubuo ng isang TT dimer.
Ang isa pang karaniwang problema na madalas na nangyayari sa molecular diagnostics ay ang hindi gaanong pinakamainam na paglabas ng mga target na nucleic acid kumpara sa phenol-chloroform extraction. Sa matinding mga kaso, maaari itong maiugnay sa mga maling negatibo. Maraming oras ang maaaring i-save sa pamamagitan ng pagkulo ng lysis o enzymatic digestion ng cell debris, ngunit ang pamamaraang ito ay kadalasang nagreresulta sa mababang PCR sensitivity dahil sa hindi sapat na paglabas ng nucleic acid.

Ang pagsugpo sa aktibidad ng polymerase sa panahon ng amplification

Sa pangkalahatan, ang pagsugpo ay ginagamit bilang isang konsepto ng lalagyan upang ilarawan ang lahat ng mga salik na humahantong sa mga suboptimal na resulta ng PCR. Sa isang mahigpit na biochemical na kahulugan, ang pagsugpo ay limitado sa aktibidad ng enzyme, ibig sabihin, binabawasan o pinipigilan nito ang conversion ng substrate-produkto sa pamamagitan ng pakikipag-ugnayan sa aktibong site ng DNA polymerase o cofactor nito (hal., Mg2+ para sa Taq DNA polymerase).
Ang mga bahagi sa sample o iba't ibang buffer at extract na naglalaman ng mga reagents ay maaaring direktang humadlang sa enzyme o ma-trap ang mga cofactor nito (hal. EDTA), at sa gayon ay hindi aktibo ang polymerase at humahantong sa pagbaba o maling negatibong resulta ng PCR.
Gayunpaman, maraming mga pakikipag-ugnayan sa pagitan ng mga bahagi ng reaksyon at mga nucleic acid na naglalaman ng target ay itinalaga rin bilang 'PCR inhibitors'. Kapag ang integridad ng cell ay nagambala sa pamamagitan ng paghihiwalay at ang nucleic acid ay inilabas, ang mga pakikipag-ugnayan sa pagitan ng sample at ang nakapalibot na solusyon at solid phase ay maaaring mangyari. Halimbawa, ang 'scavengers' ay maaaring magbigkis ng single- o double-stranded na DNA sa pamamagitan ng non-covalent interaction at makagambala sa paghihiwalay at purification sa pamamagitan ng pagbawas sa bilang ng mga target na kalaunan ay umaabot sa PCR reaction vessel.
Sa pangkalahatan, ang mga PCR inhibitor ay naroroon sa karamihan ng mga likido sa katawan at reagents na ginagamit para sa mga klinikal na diagnostic na pagsusuri (urea sa ihi, hemoglobin at heparin sa dugo), mga pandagdag sa pandiyeta (organic na bahagi, glycogen, taba, Ca2+ ions) at mga bahagi sa kapaligiran (phenols , mabibigat na metal)

Ang mas laganap na mga PCR inhibitor ay matatagpuan sa bacteria at eukaryotic cells, non-target na DNA, DNA-binding macromolecules ng tissue matrice at mga kagamitan sa laboratoryo tulad ng mga guwantes at plastik. Ang paglilinis ng mga nucleic acid sa panahon o pagkatapos ng pagkuha ay ang ginustong pamamaraan para sa pag-alis ng mga PCR inhibitor.
Sa ngayon, maaaring palitan ng iba't ibang kagamitan sa automated extraction ang maraming manu-manong protocol, ngunit hindi pa nakakamit ang 100% na pagbawi at/o paglilinis ng mga target. Ang mga potensyal na inhibitor ay maaaring naroroon pa rin sa mga purified nucleic acid o maaaring nagkaroon na ng bisa. Mayroong iba't ibang mga diskarte upang mabawasan ang epekto ng mga inhibitor. Ang pagpili ng naaangkop na polymerase ay maaaring magkaroon ng malaking epekto sa aktibidad ng inhibitor. Ang iba pang napatunayang paraan upang mabawasan ang pagsugpo sa PCR ay ang pagtaas ng konsentrasyon ng polymerase o paglalagay ng mga additives tulad ng BSA.
Ang pagsugpo sa mga reaksyon ng PCR ay maaaring ipakita sa pamamagitan ng paggamit ng internal process quality control (IPC).
Dapat gawin ang pag-iingat upang alisin ang lahat ng reagents at iba pang solusyon sa extraction kit, tulad ng ethanol, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol at phenol, mula sa nucleic acid isolate sa pamamagitan ng masusing hakbang sa paghuhugas. Depende sa kanilang konsentrasyon, maaari nilang i-activate o pagbawalan ang PCR.